Для виявлення ECL використовується субстрат люмінол який окислюється HrP у присутності H2O2 та підсилювача для отримання світла. Випромінюване світло виявляється шляхом впливу Вестерн-блоту на рентгенівську плівку або за допомогою камери CCD для захоплення світла.

Хромогенні субстрати для вестерн-блоттингу з HRP. 3,3',5,5'-тетраметилбензидин (TMB), з молекулярною масою 240,4, найчастіше використовується як субстрат для HRP в ELISA. Однак у присутності HRP і пероксиду утворюється водорозчинний синій продукт, який може випадати в осад на мембрані.

Хоча кількість субстрату на блоті є відносно постійною, кількість присутнього ферменту залежить від кількості доданого кон’югату антитіло. Забагато ферментного кон’югату, застосованого до системи Вестерн-блот, є однією з найбільших причин мінливості сигналу, темного фону, короткої тривалості сигналу та низької чутливості.

Серія субстратів Western BLoT HRP хемілюмінесцентні субстрати для виявлення антитіл, мічених пероксидазою хрону (HRP), що використовуються під час вестерн-блоттингу. Усі субстрати містять два компоненти: пероксидний реагент і розчин люмінолу/підсилювача.

Субстрат для вестерн-блотингу ECL є високочутливий, нерадіоактивний, посилений хемілюмінесцентний субстрат на основі люмінолу для легкого виявлення пероксидази хрону (HRP) на імуноблотах.

У WB білки спочатку розділяються за розміром (молекулярною масою) за допомогою гель-електрофорезу. Потім отриманий гель поміщають поруч із мембраною, виготовленою з нітроцелюлоза або полівініліденфторид (PVDF), а застосування електричного струму спонукає білки переходити з гелю на мембрану.